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Product Category采用真空冷凍干燥法保存微生物(如菌種、病毒等)或生物系統(如血液細胞、角膜等)是目前便捷的一種方法。由于凍干藥品呈多孔狀、可長期貯存、復水性好，且可恢復活性，因此冷凍干燥技術廣泛應用于制備固體蛋白質藥物、口服速溶藥物及藥物包埋劑脂質體等。從國家食品藥品監(jiān)督管理局數據庫得知，目前國內已有注射用重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、注射用重組人干擾素α2b、凍干鼠表皮生長因子、外用凍干重組人表皮生長因子、注射用重組鏈激酶、注射用重組人白介素-2、注射用重組人生長激素、注射用A群鏈球菌、注射用重組人干擾素α2b、凍干人凝血因子VⅢ、凍干人纖維蛋白原等凍干藥品已獲準上市。
目前認為凍結過程對細胞的損傷機理主要是溶質效應和機械效應。當細胞溶液的溫度降到其平衡凍結點以下一定的過冷度后，細胞外溶液首先結晶，純水的凍結使細胞間隙內的液體逐漸濃縮，電解質濃度顯著增強，溶液的pH、離子強度、滲透壓發(fā)生變化，導致細胞內的蛋白質變性以及細胞脫水死亡，即所謂的溶質效應。在預凍過程中，細胞內的水分結冰，體積膨脹，細胞內的冰晶生長對細胞膜及細胞器膜產生機械剪切破壞，稱為機械效應。冷凍速率越快，胞內冰晶形成的數量越多，機械損傷就越大。此外，凍結過程對細胞凍干效果也至關重要，如果不能提供有效的預凍條件，隨后的干燥過程也會加速細胞的損傷和死亡。生物制品的玻璃化保存是避免冰晶生長的主要措施，也是實現生物體低溫保存的主要途徑。如用海藻糖做保護劑實現了紅細胞的玻璃化保存，各項指標均達到臨床輸注標準。
真空冷凍干燥過程對細胞損傷的兩大根源是細胞膜的融合與膜脂質的相轉變。在正常生理條件下，細胞膜中的磷脂的極性基團通過與水分子結合而在空間上相互隔開，但細胞膜失水后，極性基團的聚合密度增大，膜上的蛋白質與蛋白質之間、蛋白質與脂類之間發(fā)生相互作用，以極性基團間的氫鍵結合來補償丟失水分中的氫，導致胞膜融合、破損，內容物外溢。這種強烈的相互作用還導致相轉變溫度升高，如卵磷脂在水合時的相轉變溫度約為-7℃，而在脫水時升高至約70℃。故干脂膜在室溫下處于凝膠相，很容易發(fā)生不可逆的相分離，此外，在復水過程中，處于凝膠相的脂膜會向液晶相轉變，造成膜通透性增加，使細胞內外物質自由雙向交換，導致細胞代謝紊亂。
所以應尋找適當的凍干保護劑，一方面具有較高的玻璃化溫度，在凍結過程中能降低冰晶和溶質的損失;另一方面又能在干燥過程中代替水分子穩(wěn)定細胞膜骨架，保持其完整性。
對于低溫保護作用，液體狀態(tài)下蛋白質穩(wěn)定的機理之一是“優(yōu)先排阻”假說。該假說由Timasheff等首先提出的用以解釋溶液中糖類保護作用的機制。他認為糖類不直接與生物分子結構相互作用，而是優(yōu)先與其表面的水分子結合，使得生物分子表面穩(wěn)定劑量濃度比溶液中的低，生物分子優(yōu)先水化，表面張力增加，化學勢升高，結構更穩(wěn)定；而保護劑則優(yōu)先被排斥在蛋白質區(qū)域外（即優(yōu)先排斥）。專家認為溶液中溶質(穩(wěn)定劑或去穩(wěn)定劑分子）與生物分子的優(yōu)先相互作用包括優(yōu)先排阻和優(yōu)先結合。其中優(yōu)先排阻作用穩(wěn)定生物分子結構，優(yōu)先結合作用破壞生物分子結構。溶質對生物分子穩(wěn)定性的影響取決于優(yōu)先結合與優(yōu)先排阻作用的平衡，該平衡與溶質的化學性質和生物分子的表面性質有關。
“優(yōu)先排阻”假說同樣適用于冷凍-融化過程。蛋白質保護劑在溶液中被從蛋白質表面排斥，在凍結過程中能夠穩(wěn)定蛋白質。但是優(yōu)先作用機理不能解釋用聚合物或蛋白質自身在高濃度時保護蛋白質的現象。
在凍干過程中，由于蛋白質的水合層被除去，優(yōu)先作用機理不再適用。對于凍干保護機理，仍在研究探討之中，目前主要有兩種:
經研究發(fā)現:自然界中存在的、能夠在低溫脫水狀態(tài)下存活的有機體細胞內聚集大量的二糖，常見的為海藻糖和蔗糖，故提出“水替代”假說來解釋二糖的保護機理。
該假說認為由于蛋白質分子中存在大量氫鍵，結合水通過氫鍵與蛋白質分子連接。在冷凍干燥過程中，當生物大分子失去結合水膜后，雙糖分子中的羥基能在其失水部位以氫鍵形式與之連接，及時形成一層假定的水化膜，這樣可保護氫鍵的聯結位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，在物理狀態(tài)上保持與結合水存在時相似，從而保持了生物分子的高級結構和功能，防止蛋白質因凍干而變性，使其即使在低溫冷凍和干燥失水的情況下，仍保持蛋白質結構與功能的完整性。另外，二糖的存在還有助于降低脂質的相轉變溫度T?。
如卵磷脂在蔗糖或海藻糖存在下，T?降低至-20°C，比水合的卵磷脂的T?低10°C，比無海藻糖干燥的卵磷脂的T?低90°C，這樣干膜脂質在室溫下是液晶相，避免了相分離的發(fā)生，且在復水過程中也不會發(fā)生相轉變和脂質雙分子層的泄露。
所謂玻璃化主要是指液體轉變?yōu)榉蔷B(tài)(玻璃態(tài))的固化過程。玻璃化固體分子之間的距離與液體分子間的距商沒有區(qū)別、不形成冰晶。研究發(fā)現在玻璃態(tài)下，物質兼有固體和流體的行為，黏度高，不容易形成結晶，且分子擴散系數很低，因而可將細胞膜的蛋白質分子支撐包裹起來，形成一種在結構上與玻璃狀的冰相似的碳水化合物玻璃體，使蛋白質物質的鏈段運動受阻，阻止蛋白質的伸展和沉淀，維持蛋白質分子三維結構的穩(wěn)定，從而起到保護作用。
該假說認為玻璃化是在凍干過程中保護生物材料的要求。玻璃化能夠在凍結過程中避免形成冰晶，從而可避免冰晶和溶質損傷等凍結損傷;其次，處于玻璃態(tài)的物質具有高的黏度，一般為10¹²~10¹? Pa·s，當玻璃化的保護劑包圍在生物分子的周圍時，大分子物質的分子運動和分子變性反應變得非常微弱，阻止了膜融合等由分子擴散運動造成的損傷。所以為最大限度保持細胞的活性，應保證細胞在整個凍干過程中始終處于玻璃態(tài)，即低凍結溫度和干燥溫度應始終低于系統的玻璃化溫度T’g。T’g較高的糖類和高聚物有海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖等，其中海藻糖的T’g較高，對凍干產品的保護作用更強，保存時間更長。
對于細胞的保護，氫鍵和玻璃化都是必需的，所以兩個假說并不互相排斥。舉個典型的例子具有較高T’g，葡萄糖能夠與膜基團直接相互作用，單獨使用時均不能阻止干態(tài)下脂質膜的泄漏，但兩者的組合使用能有效地保護脂質膜。所以，在血液細胞的冷凍干燥保存中宜采用二糖和高聚物組合作為凍干保護劑。
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